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北京大学化学与分子工程学院雷晓光课题组与中国医学科学院药物研究所胡海宇课题组合作，基于特洛伊木马策略发展了新型荧光探针，超级木马实现“超级细菌”-铜绿假单胞菌在复杂生物环境中的快速、超级木马高特异性甄别，为铜绿假单胞菌体内外快速、精准诊断、指导临床用药提供可视化工具。
滥用抗菌药物导致的细菌耐药对全球公共卫生构成重大威胁。细菌感染的快速、诊断是减少抗生素滥用最直接有效的方法。其中，细菌感染特异性分子探针结合医学分子影像技术，为体内外快速、准确诊断细菌感染提供了新思路。然而在复杂生物环境下，能够高特异性标记病原菌的分子探针和成像方法还十分有限。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是医院感染常见的病原菌之一，超级木马在免疫功能低下的病人中可导致高发病率和死亡率。铜绿假单胞菌外膜通透性很低，对许多临床重要的抗生素（如氨苄西林、阿莫西林和万古霉素等）具有天然耐受性，是一类名副其实的“超级细菌”。天然产物Pseudopaline是铜绿假单胞菌特有金属载体，与二价金属螯合后，通过金属转运蛋白入胞，与铜绿假单胞菌生长、耐药性密切相关。超级木马2019年雷晓光课题组率先实现了Pseudopaline化学全合成（Chem. Sci., 2019, 10, 6635–6641），近期，超级木马结合胡海宇课题组在细菌感染特异性分子探针和成像技术研究方面的优势，合作开发了系列新型pseudopaline-荧光探针，该探针的合成和作用原理类似特洛伊木马策略，超级木马用铜绿假单胞菌特有金属载体—pseudopaline与荧光基团偶联而成，可对铜绿假单胞菌进行特异性识别，结构见图1：P-FL(1), P-Cy7(2)，P-Cy5(3)。
图1. 铜绿假单胞菌特异性pseudopaline-荧光探针P-FL(1), P-Cy7(2)，P-Cy5(3)结构式
作者首先在细胞水平考察了探针分子特异性检测铜绿假单胞菌的能力。激光共聚焦荧光成像结果显示，超级木马P-FL/Zn能够很好的标记铜绿假单胞菌，而对ESKAPE病原菌中的金黄色葡萄球菌，鲍曼不动杆菌，肺炎克雷伯菌，阴沟肠杆菌，粪肠球菌及其他假单胞菌均不能标记。此外，探针与肺腺癌细胞（A549）、人胚肾细胞（HEK293T）及小鼠单核巨噬细胞系（Raw 264.7）和Hela细胞系共孵育结果显示，哺乳细胞系对探针均无反应。表明P-FL/Zn对铜绿假单胞菌具有优异的特异性（图2）。
图2. P-FL/Zn与ESKAPE病原菌、假单胞菌P. putida、P. fluorescens、哺乳细胞荧光成像图
临床生物样品往往是不同细菌混杂或细菌与哺乳动物细胞的混杂环境，作者进一步通过模拟铜绿假单胞菌与其他病原菌/哺乳细胞混杂体系，验证P-FL/Zn 探针高特异性标记铜绿假单胞菌性能。成像结果显示，P-FL/Zn 探针可以在其他病原菌或哺乳细胞存在的混杂环境中选择性检测铜绿假单胞菌，而对其他细胞无响应。
进一步，超级木马作者通过模拟铜绿假单胞菌感染胃组织体外模型，考察了在组织样本中，P-FL/Zn标记铜绿假单胞菌的性能，图4显示P-FL/Zn标记的铜绿假单胞菌表现出强荧光信号，而胃组织中未见明显信号，表明P-FL/Zn能够特异性地检测组织中的铜绿假单胞菌（图4）。
最后，作者利用开发的近红外荧光探针P-Cy7在小动物活体水平评价探针特异性检测铜绿假单胞菌能力。首先，将鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌分别感染BALB / c雌性小鼠的左右后肢，超级木马再通过尾静脉注射方式将P-Cy7/Zn注入小鼠体内，通过小动物活体成像检测近红外发光变化（图5A）。结果显示，随着时间的流逝，P-Cy7/Zn探针在小鼠右侧后肢铜绿假单胞菌感染区域富集。注射P-Cy7/Zn 2小时后，铜绿假单胞菌感染区域（红色椭圆形）和鲍曼不动杆菌感染区域（蓝色椭圆形）之间的信号表现出明显不同（图5B和5D）。为更好地模拟病原菌感染宿主活体模型，预先在小鼠左右后肢分别感染鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌，6小时后尾静脉注射P-Cy7/Zn探针，探针分子可在2小时内准确标记、定位铜绿假单胞菌感染区域（图5C，5E）。
综上所述，作者基于特洛伊木马策略构建的新型pseudopaline-荧光探针，可在多菌混合环境下、在哺乳动物细胞、组织切片中实现对铜绿假单胞菌的特异性标记，为铜绿假单胞菌感染快速、精准检测提供了新的思路。利用pseudopaline-Cy7近红外荧光探针，在小动物活体水平实现铜绿假单胞菌感染高特异性诊断与定位，其检测、成像结果不受体内其他病原菌或肠道菌群影响。研究结果为铜绿假单胞菌特异性诊断、临床指导用药、阐明细菌金属代谢的途径、新型抗生素药物发现提供新工具。
雷晓光课题组赵天湖博士、张健博士和胡海宇课题组韩小婉博士为该论文的共同作者，雷晓光教授和胡海宇研究员为共同通讯作者，该项目目前正与瑞士罗氏公司合作，积极推进后期新一代细菌感染诊断试剂及新型抗生素药物的开发。该研究成果以Research Article 的形式发表在CCS Chemistry， 已在官网“Just Published”栏目上线。
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原标题：《CCS Chemistry “特洛伊木马”荧光探针—精准甄别“超级细菌”感染新技术》
